포획: 항체 붙잡기 (프로테인 A)

📍 현재 위치: 여정의 13번째 단계이자, 첫 번째 본격적인 정제 단계입니다. 우리에게는 우리 약물에 더해 수천 가지의 원치 않는 찌꺼기까지 가득 담긴 맑은 액체 탱크가 있습니다. 이제 그 안으로 손을 뻗어 항체를 끄집어낼 차례입니다.

수확과 청징(harvest and clarification)을 거친 뒤, 우리에게는 맑은 수프가 남습니다. 우리 약물인 항체(antibody) — 면역계가 특정 표적을 붙잡는 데 쓰는 Y자 모양 단백질 — 가 그 안에 떠 있지만, 동시에 수천 가지의 원치 않는 찌꺼기도 함께 떠 있습니다. 공장 세포에서 나온 잡다한 단백질, DNA 조각, 깨진 세포 부스러기, 남은 영양분 같은 것들입니다. 포획(capture)은 항체를 낚아 올리고 나머지 대부분을 버리는 단계입니다. 이는 정제 전체에서 가장 큰 영향력을 발휘하는 단 하나의 수순으로, 똑똑한 한 단계가 작업의 대부분을 해냅니다 [1].

쉽게 말하면

모래 한 양동이에 쇠못 몇 개가 섞여 있다고 상상해 보세요. 그 위로 자석을 끌고 지나가면 못은 자석에 달라붙고, 모래는 흘러내립니다. 이제 자석을 들어 올린 다음 살며시 꺼버리면 못은 깨끗한 컵 안으로 떨어집니다. 그 자석이 바로 우리의 포획 단계입니다. 못은 항체이고, 모래는 우리가 없애고 싶은 모든 것입니다. 다만 한 가지 까다로운 점이 있습니다. 우리의 "자석"은 정확히 어떤 모양만 붙잡을지에 대해 매우 까다롭고, 못을 놓게 하려면 살짝 구슬려야 한다는 것입니다.

이 장에서 다루는 내용

먼저 도구인 크로마토그래피(chromatography) 와, 포획을 그토록 선택적으로 만들어 주는 특별한 "자석 분자" 프로테인 A(Protein A) 에서 시작하겠습니다. 그런 다음 네 단계 주기(로딩, 세척, 용출, 세정)를 따라가며, 그 결과로 그려지는 크로마토그램(chromatogram) 을 읽어 보겠습니다. 오늘날 공장에서 실제로 쓰이는 비드(bead), 실제 수치, 실제 장비를 살펴봅니다. 수지(resin) 1리터에 항체가 얼마나 들어가는지, 어떤 산이 항체를 떼어내는지, 왜 수지가 가성 세척을 견뎌야 하는지, 그리고 비용은 얼마인지를 다룹니다. 마지막으로는 포획의 현대적인, 멈추지 않는 형태인 연속 다중 컬럼 크로마토그래피와, 그것이 바로 다음 단계인 바이러스 불활성화로 어떻게 이어지는지로 마무리하겠습니다.

실제로 일어나는 일

우리가 쓰는 도구는 크로마토그래피(chromatography) 라고 불립니다. 혼합물을 관(tube) 안으로 펌프질해 통과시키면서 어떤 것은 달라붙게 하고 다른 것은 흘러가게 하여 분리하는 방법입니다.

길고 좁은 관, 즉 컬럼(column) 을 떠올려 보세요. 그 안은 작고 다공성인 비드 수백만 개로 채워져 있으며, 이를 통틀어 수지(resin) 라고 합니다. 액체는 위쪽에서 펌프로 주입되어 비드 사이를 따라 아래로 흘러내립니다. 지나가는 동안 비드는 특정 분자를 붙잡아 붙들어 두고, 나머지는 그대로 통과시킵니다. 비드는 스펀지처럼 다공성이라, 액체는 표면 위로만 미끄러지는 것이 아니라 광대한 내부 벌집 구조 속으로 스며듭니다. 바로 그곳에서 붙잡기의 대부분이 일어납니다.

포획을 위해 우리는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 라는 특별한 기법을 씁니다. 비드를 프로테인 A(Protein A) 라는 붙잡기 분자로 코팅하는데, 이 붙잡기 분자는 까다롭습니다. 프로테인 A는 원래 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 이라는 세균의 표면에서 유래했으며, 그곳에서 항체에 달라붙어 미생물이 면역계를 회피하도록 돕습니다. 우리는 바로 그 재능을 빌려 옵니다. 프로테인 A는 Y자의 아래쪽 "줄기" 부분, 즉 Fc 영역에 들러붙습니다. 이 영역은 사람 항체 중 가장 흔한 부류인 IgG(거의 모든 mAb 약물이 속하는 주력 부류)가 공유하는 부분입니다 [2].

"항체만 붙잡는다"는 비유 뒤에 숨은 정직한 단서가 있습니다. 프로테인 A는 주로 IgG를 그 Fc 줄기로 붙잡으며, 모든 항체 부류나 아부류를 똑같이 잘 결합하지는 않습니다(예를 들어 사람의 IgG3은 약하게 결합합니다). 하지만 승인된 mAb 시장의 거의 전부를 이루는 IgG형 분자에 대해서는 놀랍도록 선택적이어서, 수프 안의 다른 어떤 것도 그 손아귀에 거의 맞지 않습니다. 바로 그 선택성이 포획이 그토록 잘 작동하는 이유의 전부입니다.

주기는 단계별로 다음과 같습니다.

1. 로딩(load). 청징된 수프를 일부러 느긋한 속도로 컬럼에 펌프질해 통과시킵니다. 항체는 프로테인 A 비드에 결합하지만, 숙주세포단백질(host cell proteins, HCP — 공장 세포에서 나온 잡다한 단백질), DNA, 세포 부스러기는 대부분 달라붙지 않아 바닥으로 흘러나가 폐기됩니다. 흐름이 느린 것은 의도적입니다. 액체가 약 3~6분이라는 체류 시간(residence time) 동안 컬럼 안에 머물러야, 항체가 비드 공극 속으로 확산해 들어가 프로테인 A 붙잡기 분자를 찾을 시간을 가질 수 있기 때문입니다. 그렇지 않으면 항체는 그냥 씻겨 지나가 버립니다.
2. 세척(wash). 깨끗한 완충액(부드럽고 pH가 조절된 소금물 용액)을 흘려보내 느슨하게 매달려 있는 것들 — 약하게 붙은 불순물과 미결합 물질의 마지막 잔여분 — 을 헹궈냅니다. 항체는 그대로 붙들려 있습니다.
3. 용출(elute). 액체를 묽은 산 — 낮은 pH 완충액, 흔히 약 50100 mM 농도의 아세트산염, 시트르산염, 또는 글리신을 대략 pH 3.03.7로 — 으로 바꿉니다. 산은 프로테인 A의 모양을 딱 그 손아귀가 느슨해질 만큼만 변화시키고, 항체는 놓여나 농축되고 훨씬 순수한 흐름으로 흘러나옵니다. 이 방출을 용출(elution) 이라고 합니다.
4. 세정과 재사용(clean and reuse). 컬럼을 — 보통 수산화나트륨(가성) 용액으로 — 박박 문질러 닦고 다시 평형화하여, 다음 부하를 포획할 수 있게 합니다. 이 세정을 정치세정(clean-in-place, CIP) 이라고 합니다.

조용하지만 결정적인 세부 사항이 하나 있습니다. 항체는 산 속에 앉아 있는 것을 좋아하지 않습니다. 갓 용출된 풀(pool)은 거의 즉시 중화(neutralize) 되어 pH가 대략 5~7로 다시 올라갑니다. 다음 단계를 기다리는 동안 항체가 뭉치거나 펼쳐지지 않도록 보호하기 위해서입니다.

이 모든 과정 내내, 센서 하나가 컬럼을 떠나는 액체를 지켜보며 크로마토그램(chromatogram) 이라는 그래프를 그립니다. 이 선은 불순물이 결합하지 않은 채 쏟아져 나오는 동안에는 낮고 평평하게 유지되다가, 순수한 항체가 용출되는 바로 그 순간 높고 뾰족한 봉우리로 솟아오릅니다. 바로 그 봉우리가 우리가 거두어들이는 순간입니다.

프로테인 A 포획 주기: 항체를 Fc 줄기로 결합하고, 불순물을 세척해 폐기하며, 저pH에서 농축된 풀을 방출한 뒤, 컬럼을 세정해 재사용한다. Original diagram by the authors, created with AI assistance.

얼마나 담기고, 얼마나 깨끗해지는가

어떤 포획 수지든 그 대표 수치는 동적 결합 용량(dynamic binding capacity, DBC) 입니다. 우리가 실제로 운전하는 유속에서 비드 1리터가 항체를 몇 그램이나 붙들 수 있는지를 나타냅니다. 현대의 프로테인 A 수지는 대개 수지 1리터당 항체 약 40~80그램의 DBC에 이릅니다. 이 수치가 컬럼 크기에 관한 모든 것을 결정합니다. 가령 수확물에 항체가 수 킬로그램 들어 있다면, DBC는 얼마나 큰 컬럼이 필요한지(또는 더 작은 컬럼으로 부하 주기를 몇 번 돌려야 하는지)를 알려줍니다.

한 번의 통과로 실제로 무엇을 얻을까요? 주로 두 가지입니다. 첫째는 순도(purity) 입니다. 단 한 번의 프로테인 A 단계가 숙주세포단백질을 대략 23 자릿수 — "로그(log)" — 만큼 제거합니다. (그래서 옛날식 표현인 "불순물의 약 99퍼센트가 달라붙지 않는다"는 것은 친근한 단순화입니다. 모든 불순물 질량 의 99퍼센트가 사라진다는 뜻이 아니라, HCP가 한 번의 수순으로 23 로그, 즉 100배에서 1000배 줄어든다는 뜻입니다.) 둘째는 회수율(recovery) 입니다. 잘 운전된 포획 단계는 보통 부하한 항체의 90~95퍼센트 이상을 돌려줍니다. 약물 손실이 매우 적은 것입니다. 그리고 항체가 작은 부피의 산 속으로 떨어져 나오므로, 제품 흐름은 들어갔던 묽은 수확물에 비해 몇 배로 농축되기도 합니다. 더 높은 순도, 높은 수율, 더 작은 부피 — 이 모든 것을 한꺼번에 얻습니다. 바로 이 세 박자가 포획이 하류 공정 전체의 일꾼인 이유입니다.

왜 중요한가

이 한 단계가 정제 전체의 무거운 짐을 떠맡습니다. 단 한 번의 통과로 불순물의 대부분을 제거하고, 항체를 거의 전부 회수하며, 부피를 줄입니다. 이후의 모든 과정은 이에 비하면 미세 조정에 불과합니다.

잘못하면 그 여파가 하류로 번집니다. 수지를 과부하하면 항체가 폐기물로 빠져나가 버립니다 — 약물 손실, 돈 손실입니다. 세척이나 용출을 엉성하게 하면 불순물이 따라붙고, 남은 숙주세포단백질은 나중에 환자에게서 면역 반응을 일으킬 수도 있습니다. 게다가 바로 이 단계에서 태어나는 교묘한 불순물도 하나 있습니다. 유리 프로테인 A(leached Protein A) 입니다. 붙잡기 분자 자체가 조금씩 비드에서 떨어져 나와 용출 풀에 묻어 들어갈 수 있어, 그 자체로 추적 대상 오염물질이 됩니다. 항체 밀리그램당 프로테인 A 나노그램 단위, 즉 백만분율(parts-per-million) 수준까지 관리됩니다. 환자가 이 약물을 몸속에 곧바로 주사하기 때문에, 여기서의 순도는 사소한 문제가 아니라 곧장 안전의 문제입니다. 포획은 또한 우리가 실제로 항체를 얼마나 만들었는지를 크로마토그램 위에서 마침내 읽어낼 수 있는 첫 지점이기도 합니다.

박박 닦이도록 만들어진 수지

프로테인 A 수지는 고된 삶을 삽니다. 매 주기 사이마다 수산화나트륨 — 보통 0.1~0.5 M NaOH — 으로 세척되어, 들러붙은 불순물을 벗겨내고 떠도는 미생물을 죽입니다. 그래야 같은 비드를 수십 번, 심지어 백 번 넘게 재사용할 수 있습니다. 문제는 천연 프로테인 A 자체가 단백질이라, 그만큼의 가성 처리 아래에서는 부서져 버린다는 것입니다. 그래서 업계는 더 튼튼한 버전을 공학적으로 만들어냈습니다. 프로테인 A의 결합 도메인을 재설계하여 — 예컨대 알칼리에 민감한 아미노산인 아스파라긴(asparagine)을 다른 것으로 교체하여 — 리간드가 반복되는 가성 세정에도 손아귀를 잃지 않고 살아남도록 했습니다 [3]. 이러한 공학적으로 만들어진 알칼리 안정성 리간드(흔히 재설계된 단일 B-도메인 또는 Z-도메인의 다량체)가 바로 현대 수지를 내구성 있고 제품 그램당 운전 비용도 저렴하게 만드는 비결입니다.

실제 현장에서는 이 수지들을 상표명으로 마주하게 됩니다. Cytiva의 MabSelect SuRe 와 SuRe pcc, Purolite/Repligen의 Praesto Jetted A50, Thermo Fisher의 POROS MabCapture A, Merck의 Eshmuno A, JSR의 Amsphere A3 가 모두 알칼리 안정화 프로테인 A 수지로서, 용량과 내구성, 그리고 항체가 비드 속으로 확산해 들어가는 속도를 두고 경쟁합니다. 이들은 싸지 않습니다. 프로테인 A 수지는 공장에서 가장 비싼 단일 재료 중 하나로, 흔히 1리터당 수천 미국 달러에 이릅니다. 바로 이것이 엔지니어들이 1리터마다 최대한의 제품을 짜내는 데 그토록 신경 쓰는 이유이며, 경제성이 집약화(intensification)를 강하게 밀어붙이는 이유입니다 [7].

컬럼을 충전하고 검증하기

컬럼은 비드가 얼마나 고르게 충전되었는지만큼만 좋습니다. 베드(bed)에 채널이나 빈 구멍이 생기면 액체가 고르지 않게 내달려, 용출 봉우리를 번지게 하고 불순물을 함께 끌고 옵니다. 그래서 컬럼은 신뢰받기 전에, 무해한 추적자(소금이나 아세톤의 작은 펄스)를 주입하고 그 결과로 나오는 봉우리가 얼마나 뾰족하고 대칭적인지를 측정하여 적격성을 평가합니다. 표준 수치 두 가지가 나옵니다. HETP(이론단 상당 높이, height equivalent to a theoretical plate — 작을수록 더 촘촘하고 효율적인 베드)와 봉우리 비대칭도(peak asymmetry)(봉우리가 얼마나 한쪽으로 기울었는지 — 1.0에 가까울수록 이상적)입니다. 일반적인 포획 컬럼은 약 10~25 cm의 베드 높이(bed height) 로 운전됩니다.

시설은 자가 충전 컬럼(self-packed columns) — 현장에서 직접 충전하고 재충전하는 대형 스테인리스 또는 유리 하드웨어 — 과, 배관에 바로 연결하면 되고 한 캠페인이 끝나면 버리는 일회용 사전 충전 컬럼(single-use pre-packed columns) 사이에서 선택합니다. 후자에는 Cytiva의 ReadyToProcess 라인이나 Sartorius의 사전 충전 형식 등이 있습니다. 일회용은 세정 밸리데이션과 교차 오염 걱정을 덜어주고, 자가 충전은 아주 큰 규모에서 그램당 비용 면에서 이깁니다. 어느 쪽이든 충전 품질은 점검되고 문서화됩니다. 엉성하게 충전된 포획 컬럼은 그 뒤를 따르는 모든 단계를 조용히 오염시키기 때문입니다.

실제 현장에서는

표준 상업용 방식은 프로테인 A 플랫폼(platform) 공정입니다. 컬럼 하나를 배치(batch)로 운전하는 것입니다 — 로딩, 세척, 용출, 세정, 반복 — 대부분의 승인된 mAb에 걸쳐 같은 골격이 쓰입니다 [1]. 신뢰할 만하고, 규제 당국이 잘 이해하고 있으며, 업계 전반에서 사용됩니다. 약점은 산술입니다. 컬럼이 하나뿐이라, 세척과 용출과 세정 동안 비싼 수지가 놀고 있어, 값비싼 재료가 매 주기의 상당 부분 동안 아무 일도 하지 않습니다.

현대적 접근법은 작은 컬럼 여러 개를 서로 연결하여 포획이 결코 멈추지 않게 합니다. 일반적인 업계 용어는 주기적 향류 크로마토그래피(periodic counter-current chromatography, PCC) 이며, 다중 컬럼(multi-column) 또는 순차 다중 컬럼 포획이라고도 부릅니다. 옛 명칭인 "3MCC"는 단지 이 개념의 3컬럼 버전을 뜻했을 뿐입니다. 비결은 이렇습니다. 한 컬럼이 세척, 용출, 세정되는 동안 다음 컬럼이 이미 로딩 중이고, 거의 가득 찬 컬럼에서 빠져나오는 돌파분(breakthrough)은 줄 서 있는 다음 컬럼이 받아내어 항체가 거의 새어 나가지 않습니다. 상업용 시스템에는 Cytiva의 ÄKTA pcc, Sartorius의 Resolute BioSC, Pall의 Cadence BioSMB 가 있습니다. 이렇게 운전하면 수지 생산성(productivity) 이 대략 2~3배로 올라가고 완충액 소비가 상당히 줄어듭니다. 비싼 수지 1리터마다 기다리는 대신 거의 항상 일하기 때문입니다 [5].

연속 포획은 연속으로 공급될 때 가장 빛납니다. 다중 컬럼 포획 스키드를 관류 생물반응기(perfusion bioreactor) — 하나의 거대한 배치 대신 꾸준하고 부드러운 수확물 흐름을 쏟아내는 — 와 짝지으면, 상류와 하류가 멈췄다 가는 단계들 대신 하나로 연결된 라인처럼 함께 흐르는 통합 연속 생물공정(integrated continuous bioprocessing) 이 됩니다 [6]. 이것이 바로 미국의 NIIMBL 연구소(National Institute for Innovation in Manufacturing Biopharmaceuticals, 즉 바이오의약품 제조혁신 국립연구소로, 민관 합동 Manufacturing USA 연구소)가 이 분야가 탐색하도록 돕고 있는 방향입니다. 델라웨어 대학교와 함께 cGMP(current Good Manufacturing Practice, 즉 현행 우수 제조 관리 기준 — 의약품을 안전하고 일관되게 만들기 위한 FDA의 강제력 있는 규칙) 기준에 맞춰 지어지고 있으며 2024년 4월에 착공한 파일럿 규모 시설인 NIIMBL의 SABRE 센터(SABRE Center) 는 공정 집약화된 포획과 관련 하류 기술을 규모 확대하는 장소입니다 [9]. 여기서 정확히 짚어둘 점이 있습니다. SABRE는 직접 손으로 하는 공정 개발을 위한 물리적 시설 이지 데이터 프로그램이 아니며, 단일 컬럼 프로테인 A를 쓰는 유가식(fed-batch)이 오늘날에도 여전히 지배적인 승인 공정으로 남아 있습니다. 연속 포획은 군림하는 방식이 아니라 떠오르는 방식입니다.

이 단계가 그토록 면밀히 주시되는 이유가 하나 더 있습니다. 바로 규정집입니다. 국제 가이드라인 ICH Q6B 아래에서, 포획된 제품의 품질 속성 — 유리 프로테인 A, 숙주세포단백질(ELISA 분석법으로 측정), 잔류 숙주세포 DNA — 은 공식적으로 규격화되며, 배치가 출하되려면 충족해야 하는 허용 한계가 정해집니다 [4]. 포획은 또한 화려하지 않지만 필수적인 세부 사항들도 검증됩니다. 한 배치에서 다음 배치로 아무것도 넘어가지 않는다는 것, 수지가 여러 번 재사용된 뒤에도 여전히 제 역할을 한다는 것, 그리고 정해진 컬럼 수명을 초과하지 않는다는 것입니다. 제대로만 하면 바로 그 같은 비드가 안전하게 약물을 거듭거듭 만들어냅니다.

마지막으로, 포획은 다음 안전장치로 깔끔하게 넘겨줍니다. 그 저pH 용출 풀은 그저 편리한 화학적 결과가 아니라, 의도적이고 직교적(orthogonal)인 바이러스 제거(viral-clearance) 전략의 첫 수입니다. 항체를 낮은 pH에 잠깐 붙들어 두면 외피를 가진 많은 바이러스가 불활성화되며, 바로 그래서 포획된 풀이 그 뒤를 따르는 전용 저pH 바이러스 불활성화 단계를 미리 마련해 둡니다. ICH Q5A(R2) 같은 현대 지침은 이러한 층층이 쌓인 독립적 단계들이 함께 어떻게 바이러스 안전성을 보증하는지를 규정합니다 [8]. 생물부하(bioburden)를 낮게 유지하고 주기 사이마다 철저히 세정하면 수율과 그 안전 여유 둘 다를 지킬 수 있습니다.

핵심 용어

• 크로마토그래피(chromatography) — 어떤 분자는 달라붙고 다른 것은 흘러 지나가는 컬럼으로 혼합물을 펌프질해 통과시켜 분리하는 방법.
• 컬럼(column) — 비드로 채워져 액체가 통과해 흐르는 관.
• 수지(resin) — 컬럼 안에 채워진 작고 다공성인 수백만 개의 비드.
• 프로테인 A(Protein A) — 수지에 코팅된 세균 유래 붙잡기 분자로, IgG형 항체를 그 Fc 줄기로 선택적으로 결합한다.
• 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) — 프로테인 A 같은 맞춤형 붙잡기 분자로 하나의 특정 표적을 결합하는 크로마토그래피.
• 로딩/세척/용출(load/wash/elute) — 수프를 흘려 넣고, 느슨한 불순물을 헹궈낸 뒤, 붙잡힌 항체를 방출하는 것.
• 용출(elution) — 저pH 완충액(약 pH 3.0~3.7)을 써서 항체를 순수하고 농축된 흐름으로 놓게 만드는 것.
• 크로마토그램(chromatogram) — 시간에 따라 컬럼을 떠나는 것을 나타낸 그래프로, 높고 뾰족한 봉우리가 순수한 항체이다.
• 숙주세포단백질(host cell protein, HCP) — 공장 세포에서 나온 잡다한 단백질로, 단 한 번의 포획 단계에서 대략 2~3 로그 줄어들며 ELISA로 관리된다.
• 3MCC — 3컬럼 연속 포획 시스템을 가리키던 옛 명칭으로, 오늘날 일반 용어는 주기적 향류 크로마토그래피(PCC)이다.
• Fc 영역(Fc region) — 프로테인 A가 붙잡는, Y자 모양 항체의 아래쪽 "줄기" 부분.
• 동적 결합 용량(dynamic binding capacity, DBC) — 운전 유속에서 수지 1리터가 붙들 수 있는 항체의 그램 수(대개 약 40~80 g/L).
• 체류 시간(residence time) — 액체가 컬럼 안에 머무는 시간(로딩 시 약 3~6분)으로, 항체가 확산해 들어가 결합할 수 있게 한다.
• 유리 프로테인 A(leached Protein A) — 비드에서 제품으로 떨어져 나오는 리간드로, 백만분율 수준까지 추적된다.
• 정치세정(clean-in-place, CIP) — 컬럼을 제자리에서, 보통 0.1~0.5 M 수산화나트륨으로 박박 닦아 재사용할 수 있게 하는 것.
• 주기적 향류 크로마토그래피(periodic counter-current chromatography, PCC) — 수지를 거의 쉼 없이 일하게 하는 다중 컬럼 연속 포획.
• cGMP — 현행 우수 제조 관리 기준(current Good Manufacturing Practice)으로, 의약품을 안전하고 일관되게 만들기 위한 강제력 있는 규칙.

다음 이야기

이제 우리 항체는 농축된 저pH 풀이 되었습니다 — 우리가 시작했던 수프보다 훨씬 순수하고, 이미 산 속에 잠겨 있습니다. 이는 우연이 아닙니다. 다음 장 바이러스 불활성화(viral inactivation)에서는, 그 낮은 pH를 다시 올리기 전에 그것을 이용해 숨어 있는 바이러스를 무력화합니다 — 포획 단계의 한 특성을 바이러스에 대한 첫 전용 방어선으로 바꾸는 것입니다.