공장 세포 만들기

📍 현재 위치: 여정의 6단계 — 이제 항체 유전자를 손에 넣었으니, 평범한 살아 있는 세포를 작고 믿음직한 의약품 공장으로 바꿀 차례입니다.

지난 단계에서 우리는 완벽한 항체를 찾아내고 그 설계도를 읽어냈습니다. 바로 유전자(gene) 인데, 이는 특정 단백질 하나를 만드는 명령어를 담은 짧은 DNA 조각입니다. 하지만 유전자는 종이에 적힌 조리법에 불과합니다. 실제로 의약품을 만들려면, 살아 있는 세포가 그 조리법을 읽고 단백질을 날마다, 배치(batch)마다, 수십 년 동안 꾸준히 쏟아내야 합니다. 이 장은 바로 그런 세포를 만들고, 그런 다음 신중하게 얼리는 이야기입니다.

쉽게 말하면

세상에서 가장 맛있는 빵을 만들고 싶다고 상상해 보세요. 똑같은 조리법을 수천 명의 제빵사에게 나눠 주고, 누가 가장 좋은 품질의 빵을 가장 많이 굽는지 지켜본 뒤, 단 한 명의 챔피언을 뽑습니다. 그런 다음 그 한 명을 똑같이 복제한 대군을 만들어 얼려 둡니다. 앞으로 20년 동안 당신이 파는 모든 빵은 바로 그 제빵사를 해동한 복제본에서 나옵니다. 이 얼린 대군은 오늘의 빵이 다음 십 년의 빵과 똑같은 맛을 내도록 보장해 주며, 무엇보다 모든 빵이 어디서 왔는지 증명할 수 있게 해 줍니다.

위상차 현미경으로 본 부착 배양 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 — 대부분의 치료용 항체 뒤에 있는 포유류 세포주의 주력 일꾼입니다. 50 µm 축척 막대가 이 세포들이 얼마나 작은지를 보여 줍니다. Adherent CHO cells under phase-contrast microscopy. Image by Alcibiades, public domain, via Wikimedia Commons.

이 장에서 다루는 내용

우리는 유전자에서 출발해, 얼려서 규제 당국의 승인을 받은 종자 원료(seed stock)에 이르는 전체 여정을 따라갑니다. CHO 세포를 만나고, 그것이 왜 업계가 가장 좋아하는 숙주가 되었는지 알아봅니다. 유전자가 어떻게 세포 안으로 들어가는지(형질주입, transfection), 생존 압력이 어떻게 실패작을 걸러 내는지(선별, selection), 그리고 단 하나의 창시 세포(founder cell)를 어떻게 찾아내고 바로 그 세포임을 증명하는지(클로닝과 스크리닝)를 살펴봅니다. 그런 다음 모든 바이오의약품이 의존하는 두 단계 금고를 짓습니다. 바로 마스터 세포 은행(Master Cell Bank) 과 워킹 세포 은행(Working Cell Bank) 입니다. 그리고 이들이 어떻게 얼려지고, 시험받고, 도시별로 나뉘어 보관되고, 수십 년 동안 (신중하게) 사용되는지를 봅니다. 그 내내 하나의 질문을 놓치지 않습니다. 어째서 의약품 안전성의 그토록 많은 부분이 이 단 하나의 세포로 거슬러 올라가는가?

숙주 세포를 만나다: CHO

우리가 사용하는 세포는 거의 언제나 CHO 세포(Chinese Hamster Ovary cell, 중국 햄스터 난소 세포) 입니다. 1950년대에 처음 확립되어 수십 년에 걸쳐 바이오의약품 산업의 지배적인 주력 일꾼으로 다듬어진 포유류 세포주입니다. 승인된 단일클론항체(monoclonal antibody, mAb) 치료제의 대다수가 CHO 세포에서 만들어지며, 현대의 CHO 배양은 배양액 리터당 그램(grams per litre) 수준의 역가(titer)로 항체를 분비할 수 있습니다. 초기의 리터당 밀리그램 수율에 비하면 천 배의 향상입니다 [1]. (역가(titer) 란 세포가 배양액 리터당 만들어 내는 산물의 양을 가리킬 뿐입니다.)

왜 세균이 아니라 CHO일까요? 항체는 당사슬로 장식된 크고 접힌 단백질이며, 이 당 패턴을 당화(glycosylation) 라고 부릅니다. 이 당들은 약이 환자에게 안전하게 작동하려면 충분히 사람의 것처럼 보여야 합니다. 세균은 사람과 비슷한 당을 전혀 붙이지 못하지만, CHO 세포는 할 수 있습니다. CHO는 또한 큰 스테인리스강 탱크나 일회용 탱크에서 부유 상태로 잘 자라고, 산업적 배양의 화학적 조건을 견디며, 규제 당국에게 중요한 점으로 — 알려져 있고 관리 가능한 바이러스 프로필을 포함해 잘 규명된 긴 안전성 이력을 갖고 있습니다 [6]. CHO는 "광범위하게 연구되었고 예측 가능하게 행동하는" 세포이며, 같은 세포가 20년 동안 의약품을 만들 때 우리가 원하는 것이 바로 그 점입니다.

유전자에서 창시 세포까지

평범한 CHO 세포가 어떻게 전용 항체 공장이 되는지 살펴봅시다.

1. 형질주입(Transfection) — 유전자를 세포 안으로 넣기. "형질주입"이란 세포가 항체 DNA를 읽을 수 있도록 그것을 세포 안으로 전달한다는 뜻일 뿐입니다. 우리는 수백만 개의 CHO 세포를 한꺼번에 유전자에 노출시키지만, 대부분의 세포는 아무것도 받아들이지 않습니다. 흔히 쓰이는 두 가지 방법은 속도와 부드러움 사이에서 절충을 합니다. 전기천공(electroporation) 은 짧은 전기 펄스로 세포에 충격을 주어 막에 일시적인 구멍을 여는 방법으로, 이를 위해 만들어진 상용 장비 — 이를테면 론자(Lonza)의 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector) 나 바이오라드(Bio-Rad)의 진 펄서(Gene Pulser) — 는 생존한 세포의 상당 부분에 DNA를 넣을 수 있습니다 [2]. 반면 지질주입(lipofection) 은 DNA를 작은 지방 거품으로 감싸 막과 융합시키는 방법으로, 다루기는 더 부드럽지만 대개 효율이 낮고 필요한 용량에서는 독성이 더 클 수 있습니다. 어느 쪽이든, 운 좋은 소수의 세포가 새 유전자를 자기 염색체 안으로 끼워 넣어, 모든 자손에게 물려줄 수 있게 됩니다.

2. 선별(Selection) — 유전자 보유자의 생존. 이제 우리는 새 유전자를 유지하고 사용하는 세포만 살아남을 수 있도록 압력을 가합니다. 그 비결은 항체 유전자와 함께 세포가 필요로 하는 "생존 유전자"를 전달하고, 그런 다음 그 유전자의 단백질이 만들어 주는 것을 빼앗는 것입니다. 널리 쓰이는 글루타민 합성효소(glutamine synthetase, GS) 시스템 에서는 세포에서 아미노산 글루타민을 굶깁니다. 그러면 추가된 GS 효소를 발현하는 세포만 스스로 글루타민을 만들어 살아남을 수 있습니다. 더 오래된 메토트렉세이트(methotrexate, MTX) / DHFR 시스템 에서는 약물(메토트렉세이트)이 세포가 필요로 하는 효소를 차단하고, 구원 유전자를 여러 사본 지닌 세포만 뚫고 살아남으며 — 그 과정에서 항체 유전자의 사본 수도 함께 높아집니다 [2]. 선별은 대개 2~4주 에 걸쳐 진행되며, 수백만 개의 세포 집단을 훨씬 적은 수의 생존자 무리로 솎아 냅니다. 이제 그들 하나하나가 확인된 유전자 보유자입니다. 그러나 생존자들이 모두 같지는 않습니다. 어떤 세포는 항체를 졸졸 흘리듯 만들고, 어떤 세포는 홍수처럼 만들며, 어떤 세포는 불안정합니다.

3. 클로닝(Cloning) — 단 하나의 창시 세포 찾기. 이것이 결정적인 부분이며, 이 장이 존재하는 이유입니다. 우리는 각 세포가 홀로 있도록 세포들을 분리한 다음, 단일 세포 하나하나가 자기만의 작은 군집으로 자라게 합니다. 분리된 창시 세포 하나에서 자란 집단을 클론(clone) 이라고 합니다. 이를 산업적 엄밀함으로 해내기 위해, 실험실은 단일 세포를 96웰 또는 384웰 플레이트 의 웰에 분주합니다. 방법은 한계 희석(limiting dilution) — 세포를 매우 묽게 희석해 평균적으로 웰마다 한 개씩 들어가게 하는 것 — 이거나, 유세포 분석 단일세포 분주(flow-cytometry single-cell sorting) — 기계가 웰마다 정확히 한 개의 세포를 떨어뜨리고 종종 그것을 촬영해 혼자였음을 증명하는 것 — 입니다. 현대의 자동 이미저는 분주 순간 각 웰을 기록해, 규제 당국이 기대하는 클론성 보증(assurance of clonality) — 군집이 단일 세포에서 자랐다는 시각적 증거 — 을 제공합니다 [3].

4. 스크리닝(Screening) — 후보 시험. 전형적인 산업 캠페인은 대략 500개에서 5,000개 범위의 클론을 분리하고 스크리닝하며(소규모 프로그램은 더 적게, 고처리량 플랫폼은 더 많이), 이들을 약 3~6개월 에 걸쳐 추려 냅니다 [2]. 살아남은 각 후보는 동시에 여러 축에서 평가됩니다. 높은 역가(titer), 건강한 성장 속도, 그리고 — 그에 못지않게 중요한 — 산물 품질 입니다. 연구팀은 응집체(aggregates)(뭉치고 잘못 접혀 안전하지 않을 수 있는 항체), 전하 변이체(charge variants)(분자들 간의 미묘한 화학적 차이), 그리고 무엇보다 중요한 당화 패턴을 측정합니다. 빨리 자라지만 미묘하게 잘못된 단백질을 만드는 클론은 탈락합니다. 목표는 생산성이 높고 동시에 올바른 분자를 만들며 동시에 여러 세포 세대에 걸쳐 안정적으로 유지되는 단 하나의 창시 세포입니다 [4].

왜 클론성은 타협 불가능한가

그 단 하나의 챔피언 클론이 이 제품의 세포주(cell line) 가 됩니다. 모든 세포가 단 하나의 창시 세포에서 유래하므로, 그 집단은 클론성(clonal) 을 띠며 — 클론성은 생산용 세포 은행에 대한 규제상의 기대이지, 있으면 좋은 부가물이 아닙니다. ICH Q5D(세포 기질의 유도와 특성 규명에 관한 조화된 표준)에 닻을 내린 국제 지침은, 세포 은행이 충분히 문서화된 이력을 지닌 단일 클론 분리주에서 출발하는 것으로 규정합니다 [5]. 업계 자체의 합의는, 클론 유도가 일관성을 떠받치기 때문에 중요하다는 것이며 — 동시에 클론성은 완벽함의 마법 같은 보증이 아니라 더 넓은 관리 전략의 한 요소라는 점을 솔직하게 인정합니다 [3].

미묘하지만 중요한 진실 하나. 출발점 에서의 클론성이 세포주를 영원히 호박 속에 가두어 굳히지는 못합니다. CHO 게놈은 가만있지 않습니다. 수많은 분열을 거치는 동안 클론은 돌연변이를 얻거나, 삽입된 유전자를 침묵시키거나, 생산성이 표류할 수 있습니다 [4]. 바로 그 때문에 우리는 ICH Q5B 의 틀을 사용해, 올바른 항체 암호화 서열이 통합되어 있으며 세포 은행에서 생산 종료까지 온전히 유지된다는 점도 확인합니다 [9]. 클론성은 깨끗하고 단일 기원인 출발점을 주고, 지속적인 특성 규명이 그것을 계속 신뢰할 수 있게 지켜 줍니다.

단일세포 클로닝은 클론성과 일관성을 보장합니다. 초기 산업 풀과 달리, 현대 제약 세포주는 단 하나의 창시 세포에서 출발하며, 마스터(MCB)와 워킹(WCB) 세포 은행으로 얼려지기 전에 높은 역가, 낮은 응집체, 유전적 안정성을 시험받습니다. Original diagram by the authors, created with AI assistance.

두 단계 금고: MCB와 WCB

창시 클론을 얻고 나면, 우리는 그것을 그냥 실험대 위에서 계속 키우지 않습니다. 단 한 번의 오염이나 냉동고 사고가 제품 전체를 지워 버릴 수 있기 때문입니다. 대신 우리는 모든 바이오의약품이 의지하는 시스템인 두 단계 세포 은행(two-tier cell bank) 을 짓습니다 [7].

마스터 세포 은행(Master Cell Bank, MCB). 우리는 창시 클론을 확장한 다음, 그 하나의 균일한 배양물을 동일한 바이알 한 세트로 나눕니다. 대개 수백 개(흔히 200~500개 범위)이며, 각 바이알에는 약 12 mL의 세포가 mL당 대략 100만500만 개의 생존 세포 농도로 담깁니다. 바이알들은 이 확장된 창시 배양물에서 직접, 약 10% 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) — 얼 때 얼음 결정이 세포를 찢지 못하도록 막는 동결보호제 — 를 첨가한 배지에서 한 번 얼려집니다. 그런 다음 액체 질소(liquid nitrogen) 에 보관됩니다. 여기서 "영하 196°C"라는 친근한 줄임말이 약간 틀린 점이 있습니다. 액체 질소 위 기상(vapor phase) 에 보관된 바이알은 대략 −150°C에서 −180°C 에 있고, 액상(liquid phase) 에 잠긴 바이알은 약 −196°C 에 도달합니다. 둘 다 규제 당국이 허용합니다. 기상 보관은 공유된 액체로 인한 교차오염 위험을 피하기 때문에 매우 흔하고, 액상 보관은 더 차갑게 유지되어 가장 장기간 보관에는 종종 선호됩니다. 공통점은 단지 생명이 멈춰 있다는 것입니다. 이 얼린 세트 — MCB — 는 대체 불가능한 종자 원료이며, 하류의 모든 것이 거슬러 올라가는 단 하나의 원천입니다.

워킹 세포 은행(Working Cell Bank, WCB). 우리는 일상 작업을 위해 귀중한 MCB에 손을 대지 않습니다. 대신 MCB 바이알 하나를 해동해, 짧고 정해진 수의 계대(passage) 동안 — 보통 몇 차례, 5~10회 집단 배가(population doublings) 정도 — 키운 다음, 그 배양물에서 새 바이알을 얼립니다. 이것이 WCB이며, 하나의 MCB 바이알로 수천 개 의 WCB 바이알(흔히 2,000~5,000개 범위)을 만들 수 있습니다. 각 WCB 바이알도 마찬가지로 한 번 얼려집니다. WCB는 실무용 공급원입니다. 모든 생산 배치는 WCB 바이알 하나를 해동하는 것으로 시작합니다. 위계는 엄격하고 한 방향입니다. 창시 클론이 MCB를 만들고, MCB가 WCB를 만들며, 일상 제조에 닿는 것은 WCB뿐입니다 [7]. WCB가 떨어져 갈 때는 또 다른 MCB 바이알을 해동해 새 WCB를 만듭니다. 다시 클로닝하거나 다시 유도하지 않습니다.

어느 은행이든 출하되기 전에는 혹독하게 시험받습니다. 무균성과 마이코플라스마(mycoplasma)(작고 흔한 오염 세균), 세균, 진균으로부터의 자유가 확인됩니다. 은행의 동일성(identity) — 정말로 CHO이고 정말로 이 제품의 세포주인지 — 은 동위효소 분석이나 STR(short tandem repeat, 짧은 직렬 반복) 프로파일링 같은 방법으로 검증됩니다. 그리고 바이러스 안전성(viral safety) 은 ICH Q5A(R2) 에 따라 외래성(초대받지 않은) 인자에 대해 평가됩니다 [6]. 이러한 특성 규명에 대한 기대는 국제적으로 WHO 기술보고서 시리즈 978(WHO Technical Report Series 978) 에 명시되어 있고 [7], 미국에서는 세포 기질의 적격성 평가에 관한 FDA 지침과 21 CFR Part 211 의 cGMP 요건에 명시되어 있습니다. 여기서 cGMP 는 current Good Manufacturing Practice(현행 우수 제조 관리 기준)의 약자로, 의약품을 안전하고 일관되게 만들기 위한 미국의 구속력 있는 규정입니다 [8].

왜 중요한가

이 단 하나의 세포주가 뒤따르는 모든 것의 원천입니다. 미래의 모든 배치는 WCB 바이알 하나를 해동하는 것으로 시작되므로, 세포주의 품질은 말 그대로 의약품에 영원히 새겨집니다. 표류하거나 미묘하게 잘못된 단백질을 만드는 클론을 고르면, 수십 년 동안의 모든 투여분에 결함을 박아 넣은 셈이 됩니다. 잘 고르고, 모든 것을 문서화하면, 그것을 만든 과학자들의 경력보다 오래 버틸 수 있는 안정적인 토대를 갖게 됩니다.

클론성과 세포 은행은 또한 추적성(traceability) 을 줍니다. 환자의 의약품이 궁극적으로 어느 바이알에서 나왔든, 그것을 이 얼린 은행들로, 거기서 다시 단 하나의 창시 세포와 그 문서화된 이력으로 곧장 추적할 수 있습니다. 몇 년 뒤 의문이 생긴다면 — 품질 신호, 감사, 규제 질의 — 제조사는 정확한 은행, 정확한 창시 세포, 정확한 기록을 가리킬 수 있습니다 [5]. 그것이 환자 안전의 등뼈입니다. 5,000번째 배치가 첫 번째 배치만큼 안전하고 효과적이라고 신뢰할 수 있는 이유 가 바로 그것입니다.

실제 현장에서는

훌륭한 세포주를 만드는 데는 거의 일 년과 수천만 달러가 들기 때문에, 기업들은 자기 은행을 왕관의 보석처럼 지킵니다. 표준 관행은 지리적 이중화(geographic redundancy) 입니다. MCB는 물리적으로 나뉘어, 주된 바이알은 한 시설의 액체 질소 냉동고에, 백업 바이알은 다른 건물, 다른 도시, 또는 계약된 제3자 보관소의 냉동고에 둡니다. 그래야 단 한 번의 냉동고 고장, 화재, 홍수가 세포주를 지워 버릴 수 없습니다. 이 보유 물량은 문서화된 순환 및 모니터링 일정을 따르고, 보관된 백업 바이알은 주기적으로 (흔히 3~5년마다) 꺼내어 해동 시험을 하여, 세포가 여러 해 동안 차가운 곳에 있은 뒤에도 여전히 생존 가능하고 안정적인지를 확인합니다.

하나의 은행은 얼마나 오래 쓸 수 있을까요? 실제로 하나의 MCB는 제품의 상업적 수명 전체 — 흔히 20년 이상 — 를 떠받칠 수 있지만, 영원히 키워서 그러는 것은 아닙니다. 세포주는 정해진 최대 계대 수(maximum passage number) 까지만 사용됩니다(흔히 수십 계대 정도로 상한이 정해지며, 세포주는 종종 생산 연구에서 대략 50~100 계대 까지 안정함이 입증됩니다). 그 한계를 넘으면 새 MCB 바이알에서 다시 유도해야 합니다. 규제 당국은 이러한 유전적·후성유전적 표류를 시간에 따라 특성 규명하고 그 시험관 내 세포 연령 한계(limit of in-vitro cell age) 를 명확히 정하는 것을, ICH Q5D [5] 및 ICH Q5B [9] 의 세포 기질 및 발현 구성체 기대와 일관되게 점점 더 강조하고 있습니다 [4]. 그러므로 "수십 년 동안 사용된다"는 것은 은행 의 수준에서 참이며, 각각의 개별 배양 실행은 젊고 한계 안에서 유지됩니다.

이것이야말로 미국의 민관 협력 노력이 관심을 갖는 종류의 견고하고 잘 문서화된 토대입니다. NIIMBL(National Institute for Innovation in Manufacturing Biopharmaceuticals, 미국 바이오의약품 제조 혁신 연구소) — Manufacturing USA 연구소 중 하나 — 는 바이오의약품 제조를 더 빠르고, 더 저렴하고, 더 신뢰할 수 있게 만드는 일을 하며, 델라웨어 대학교(University of Delaware)에 있는 그 파일럿 규모의 SABRE 센터(2024년 4월에 착공한 cGMP 시설)는 현대적 공정 기술을 시연하고 가르치기 위해 건설되고 있습니다. 신뢰할 수 있는 세포주는 그 모든 것의 상류 전제 조건입니다. 산물을 만드는 믿음직한 세포가 있어야만 더 나은 공정 을 시연할 수 있습니다. 여기서 만든 세포주는 다음으로 종자 트레인과 생산 바이오리액터에 공급되며, 공장이 표준 유가식 배양(fed-batch) 공정을 돌리든 현대적 관류(perfusion, 연속) 공정을 돌리든 마찬가지입니다. 세포주가 먼저이고, 그것을 어떻게 키울지의 선택은 그다음입니다.

핵심 용어

• CHO 세포(CHO cell) — 중국 햄스터 난소 세포. 항체 의약품 제조에 쓰이는 지배적인 포유류 숙주로, 사람과 비슷한 당화와 긴 안전성 이력으로 높이 평가됩니다.
• 형질주입(Transfection) — 세포가 항체 유전자를 읽을 수 있도록, 전기천공이나 지질주입으로 유전자를 세포 안에 넣는 것.
• 선별(Selection) — 새 유전자를 유지하고 발현하는 세포만 살아남도록 생존 압력(예: GS 또는 MTX 시스템)을 가하는 것.
• 클론(Clone) — 모두 단 하나의 창시 세포에서 유래한 세포 집단.
• 클론성(Clonality) — 세포주가 단 하나의 창시 세포에서 나온다는 성질. 생산용 세포 은행에 대한 규제상의 기대이며, 일관성을 떠받칩니다.
• 세포주(Cell line) — 제품에 사용되도록 선택된, 생산성이 높고 안정적인 단 하나의 클론. 정해진 계대 한계 안에서 사용됩니다.
• 역가(Titer) — 배양물이 얼마나 많은 항체를 만드는지, 보통 리터당 그램으로 측정.
• 당화(Glycosylation) — 항체를 장식하는 사람과 비슷한 당사슬. CHO 세포는 만들 수 있고 세균은 만들 수 없는 핵심 품질 속성.
• 응집체 / 전하 변이체(Aggregates / charge variants) — 클론 선별 중에 걸러 내는 품질 결함(뭉친 단백질, 미묘한 화학적 차이).
• 동결보호제(Cryoprotectant, DMSO) — 얼음 결정이 세포를 죽이지 못하도록 동결 전에 첨가하는 화학물질(약 10% DMSO).
• 마스터 세포 은행(Master Cell Bank, MCB) — 창시 클론에서 한 번에 만든 동일한 얼린 바이알 원본 세트. 보호되는 종자 원료.
• 워킹 세포 은행(Working Cell Bank, WCB) — 해동한 MCB 바이알에서 한 번에 만든 바이알로, 일상 생산 배치를 시작하는 데 사용.
• 최대 계대 수(Maximum passage number) — 새 MCB 바이알에서 다시 유도하기 전에 배양물을 키울 수 있는 횟수의 정해진 상한.
• 추적성(Traceability) — 어떤 배치든 그 정확한 출처 세포 은행, 창시 세포, 문서화된 기록으로 거슬러 추적할 수 있는 능력.

다음 이야기

이제 우리는 대체 불가능한 것을 갖게 되었습니다. 단일하고, 클론성을 띠며, 생산성이 높고, 충분히 문서화된 세포주가 얼려져 마스터 세포 은행과 워킹 세포 은행으로 나뉘어 있습니다. 하지만 훌륭한 세포도 우리가 그것을 키우는 조건만큼만 좋을 뿐입니다. 다음 장, 조리법을 완성하기(공정 개발) 에서는 냉동고를 떠나 실험대로 가서, 이 세포에게 가장 좋은 조리법 — 알맞은 먹이, 온도, 산소, 그리고 단계의 순서 — 을 찾습니다. 그것이 세포를 구슬려 가장 높은 품질의 의약품을, 믿음직하게, 대규모로 만들게 합니다.