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수확: 세포와 의약품 분리하기

📍 현재 위치: 2부(상류 공정)의 마지막입니다. 세포는 제 역할을 끝냈습니다. 이제 세포가 만들어 낸 의약품을 거두어 정제 팀에게 넘겨줄 차례입니다.

지난 장에서 살펴본 큰 탱크, 즉 생산 바이오리액터(production bioreactor)는 이제 뿌연 수프로 가득 차 있습니다. 그 수프 속에는 수십억 개의 작은 세포, 세포가 2주 동안 분비한 항체 의약품, 그리고 깨진 세포에서 나온 잔해 슬러리가 떠다닙니다. **수확과 정화(harvest and clarification)**라고 부르는 이 단계에서 우리는 세포를 버리고, 의약품을 담고 있는 맑은 액체만 남깁니다.

쉽게 말하면

집에서 끓인 뿌연 육수가 큰 냄비 가득 있다고 상상해 보세요. 당신이 원하는 것은 맑은 국물뿐이지, 건더기가 아닙니다. 그래서 무거운 건더기는 가라앉히고, 맑은 부분만 따라 낸 다음, 점점 더 고운 체에 걸러 투명하게 부어질 때까지 거릅니다. 수확이 하는 일이 바로 이것입니다. 다만 거대하고, 초청정하며, 아주 정밀하게 측정되는 규모에서 이루어지고, 그 맑은 액체 속에 항체라는 상품이 숨어 있다는 점이 다를 뿐입니다.

이 장에서 다루는 내용​

우리는 뿌연 육수가 바이오리액터를 떠나 정제 준비가 끝난 맑고 세포 없는 액체로 바뀌는 과정을 따라가 보겠습니다. 실제로 그 일을 해내는 두 기계, 즉 산업용 원심분리기(centrifuge)와 층상 심층 필터(depth filter)를 엔지니어가 실제로 사용하는 힘, 기공 크기, 유속과 함께 보게 될 것입니다. 여기서 "깨끗하다"는 말이 무엇을 뜻하는지 숫자로 짚어 보겠습니다. 세포 자체의 단백질과 DNA가 얼마나 제거되는지, 그리고 액체가 뿌연 상태에서 얼마나 맑은 상태로 바뀌는지 말입니다. 또한 이 작업을 너무 세게, 너무 뜨겁게, 혹은 너무 느리게 하면 연약한 단백질이 어떻게 손상되는지, 그리고 그것을 안전하게 지키는 규정집(cGMP(current Good Manufacturing Practice, 현행 우수 제조 관리 기준)와 ICH 가이드라인)도 살펴보겠습니다. 마지막으로, 미국 NIIMBL 연구소와 그 SABRE 파일럿 시설이 개척을 돕고 있는 현대적 연속 공정이 어떻게 세포를 탱크 안에 붙들어 두면서 의약품을 날마다 부드럽게 흘려보내는지 보게 될 것입니다.

실제로 무슨 일이 일어나는가​

바이오리액터를 떠나는 액체를 배양액(broth) 또는 **수확물(harvest)**이라고 부릅니다. 이 액체에는 우리가 원하는 항체가 풍부하지만, 동시에 우리가 원치 않는 것들도 어지럽게 섞여 있습니다. 온전한 세포(현대적인 유가식(fed-batch) 배양에서는 흔히 밀리리터당 1,000만~4,000만 개), 세포 조각, 그리고 그 세포들이 내놓는 용해된 찌꺼기인 **숙주세포 단백질(host cell proteins, HCPs, 세포 자신의 단백질)**과 **숙주세포 DNA(host cell DNA)**가 그것입니다. 여기서 우리의 목표는 좁지만 중요합니다. 항체를 해치지 않으면서, 빠르고 부드럽게 세포와 잔해를 빼내는 것입니다.

보통 두 단계가 차례로 진행됩니다.

1단계 — 원심분리​

배양액은 **원심분리기(centrifuge)**라는 기계 안에서 매우 빠르게 회전됩니다. 회전은 중력보다 훨씬 강한 힘을 만들어 내는데, 이 힘은 g(1g는 정상 중력)의 배수로 측정됩니다. 그래서 무거운 세포는 바깥쪽으로 내던져져 빽빽한 층을 이루고, 더 맑은 액체는 중심 쪽에 남아 그곳에서 빠져나옵니다 [1]. 이것은 세탁기 탈수가 옷에서 물을 짜내는 것과 같은 물리 원리입니다. 다만 세탁기가 수백 g에 이르는 데 비해, 수확용 원심분리기는 훨씬 더 세고 차갑게 돌아갑니다.

원심분리기에도 종류가 여러 가지이며, 어느 것을 고를지는 규모와, 단일 배치를 처리하는지 아니면 연속 흐름을 처리하는지에 따라 달라집니다 [2]:

  • **디스크-스택 원심분리기(disk-stack centrifuge)**는 대규모 유가식 수확의 주력 장비입니다. 보울 안에 촘촘히 쌓인 원뿔 모양 디스크 더미가 대략 10,000~20,000g로 회전하여, 세포가 표면에 부딪혀 보울 벽으로 미끄러져 내려가기까지 이동해야 할 거리를 아주 짧게 만듭니다. 무엇보다 이 장비는 연속적으로 돌아갑니다. 배양액이 들어오고, 정화된 액체가 흘러나오며, 고형물은 타이머에 맞춰 배출됩니다. 그래서 기계 한 대가 분당 수십 리터의 유속으로 수천 리터를 정화할 수 있습니다. 자주 언급되는 공급사로는 알파라발(Alfa Laval, Westfalia), GEA, ANDRITZ SEPARATION 등이 있습니다.
  • **관형 보울(또는 바스켓) 원심분리기(tubular-bowl/basket centrifuge)**는 더 부드럽게 회전하며, 흔히 2,000~3,500g로 한 번에 한 배치씩 처리하여 고형물을 떼어 낼 수 있는 바스켓에 쌓습니다. 비교적 적은 부피(대략 100~2,000L)와 더 부드러운 작업에 알맞으며, Carr와 Flottweg가 대표적인 이름입니다.
  • **챔버 원심분리기(chamber centrifuge)**는 일부 관류(perfusion) 설비에서 사용되는데, 여기서는 똑같이 부드러운 정화가 몇 주 동안 쉬지 않고 이어져야 합니다.

이 과정 내내 배양액은 차갑게, 보통 2~8°C로 유지됩니다. 차가운 온도는 세포가 단백질을 더 많이 새어 나오게 하거나 항체가 뭉치게 만드는 화학 반응을 늦추기 때문입니다. 기계 전체는 밀폐되고 멸균 가능한 스테인리스강 시스템인데, 이 작업의 어느 부분도 실내 공기에 노출되어서는 안 되기 때문입니다 [5].

2단계 — 심층 여과​

원심분리기를 떠난 액체는 눈에는 맑아 보이지만, 여전히 미세한 입자들의 안개를 품고 있습니다. 마이크론 이하의 세포 조각, 콜로이드, 그리고 회전으로 잡아내지 못한 부스러기들입니다. 그래서 이 액체는 **심층 필터(depth filter)**를 통과합니다. 심층 필터는 표면 하나가 아니라 두껍고 층진 패드로, 표면뿐 아니라 그 깊이 전체에서 입자를 붙잡습니다 [3].

핵심은 *설계된 기울기(engineered gradient)*입니다. 매질은 액체가 통과하면서 기공이 점점 더 고와지도록 만들어집니다. 공칭 등급이 패드를 가로질러 단계적으로 낮아지는데, 흔히 입구 면의 약 10µm에서 안쪽 깊은 곳의 약 0.2µm까지 좁아집니다(1마이크론, 즉 µm는 1밀리미터의 1,000분의 1이며, 사람 머리카락은 굵기가 약 70µm입니다). 굵은 부스러기는 처음의 성긴 층에서 먼저 걸리고, 가장 미세한 입자는 빽빽한 마지막 층 깊숙이 박힙니다. 매질 자체는 보통 규조토(diatomaceous earth, 곱고 다공성인 광물 가루)를 함유한 셀룰로스 섬유로 되어 있으며, 때로는 하전 수지(charged resin)를 더해 일부 불순물이 단지 크기 때문이 아니라 정전기적 인력으로 달라붙게 합니다. 흔한 공급사로는 Pall(현 Cytiva/Danaher), Sartorius, Merck Millipore, Asahi Kasei 등이 있습니다.

이 필터를 운용하는 엔지니어에게 두 가지 숫자가 중요합니다. 첫째는 플럭스(flux), 즉 필터 1제곱미터당 액체가 얼마나 빠르게 통과하는지로, 보통 시간당 제곱미터당 10~100리터이며, 이 값이 필요한 필터 면적을 결정합니다. 둘째는 잔류 부피(hold-up volume), 즉 작업이 끝났을 때 패드 안에 스며 남아 있는 귀중한 정화 액체로, 항체를 필터와 함께 버리지 않도록 신중한 버퍼 세척으로 회수합니다.

이 모든 과정에서 나오는 것이 바로 **정화 수확물(clarified harvest)**입니다. 맑고 거의 무색이며, 세포가 없고, 다음 단계를 위한 준비가 끝난 액체입니다.

항체 수확에 사용되는 디스크-스택 원심분리기와 심층 필터 카트리지의 모식도로, 내부 흐름 경로, 원심력 구역, 제어 지점을 보여 준다. 2단계 수확: 디스크-스택 원심분리(왼쪽)는 10,000~20,000g를 이용해 세포를 방사상으로 침전시키고, 심층 여과(오른쪽)는 층진 매질 기질 전체에 걸쳐 미세 불순물을 붙잡는다. 현대적 시스템은 이 둘을 단일 cGMP 준수 스키드로 통합하여 온도, 압력, 투명도를 인라인으로 모니터링한다. Original diagram by the authors, created with AI assistance.

"맑다"는 것과 "순수하다"는 것은 다르다​

이 장에서 가장 중요한 단 하나의 개념이 여기 있습니다. 맑다고 해서 순수한 것은 아닙니다. 정화 수확물 한 병을 빛에 비추어 보면 깨끗한 물처럼 보입니다. 뿌연 기운은 사라졌고, **탁도(turbidity, NTU 즉 네펠로법 탁도 단위로 읽는 흐림 정도)**는 원시 배양액의 1,000 NTU 이상에서 약 5 NTU 미만으로 떨어졌습니다. 하지만 그 맑은 액체 속에는, 눈에 보이지 않게, 여전히 엄청난 수의 불순물 분자가 녹아 있습니다.

실제 숫자로 말해 보겠습니다. 정화는 보통 숙주세포 단백질을 약 2~3 로그(log) 제거합니다. 다시 말해 HCP 수준을 대략 100분의 1에서 1,000분의 1로 나누어, 약 10,000100,000 ppm에서 약 1001,000 ppm으로 낮춥니다(여기서 ppm은 항체 1밀리그램당 HCP 나노그램 수를 뜻합니다) [3]. 숙주세포 DNA도 비슷하게 2~4 로그 떨어집니다. 큰 감소이고, 이중 단계 여과로 더 밀어붙일 수도 있지만, 최종 제품의 청정도와는 거리가 멉니다. 안전한 의약품은 HCP를 한 자릿수 ppm으로, DNA를 1회 투여량당 피코그램(picogram) 단위로 측정해야 합니다. 정화는 세포와 대량 잔해만 걷어 낼 뿐입니다. 남아 있는 HCP, DNA, 그리고 그 밖의 원치 않는 분자를 빼내는 정밀한 분자 수준 정제는 뒤따르는 크로마토그래피 장에서 이루어집니다 [4].

왜 중요한가​

이 단계는 두 세계 사이의 문입니다. 이 단계 이전의 모든 것은 **상류(upstream, 세포를 키우는 일)**입니다. 이 단계 이후의 모든 것은 **하류(downstream, 제품을 정제하는 일)**입니다. 수확은 한쪽이 끝나고 다른 쪽이 시작되는 정확한 경계입니다. 큰 그림 개요에서 더 자세히 읽을 수 있습니다. 그리고 세월이 흐르며 상류 역가(titer)가 높아지면서, 즉 수십 년 전 리터당 1그램 미만이던 것이 오늘날 리터당 5~10그램으로 오르면서, 수확과 정화는 조용히 병목이 되었습니다. 항체가 1그램 늘어날 때마다 걷어 내야 할 세포와 잔해도 함께 더 늘어나기 때문입니다 [7].

이 단계를 잘 해내는 일이 중요한 데에는 구체적인 두 가지 이유가 있습니다.

첫째, 항체는 연약합니다. 너무 세게 돌리거나, 너무 뜨거워지거나, 너무 오래 걸리면 단백질이 손상되거나 **응집체(aggregates, 뭉쳐서 잘못 접힌 단백질)**로 뭉칠 수 있습니다. 그리고 응집된 의약품은 효과가 떨어질 뿐 아니라 잠재적으로 안전하지 않아 출하될 수 없습니다. 손상에는 두 가지 주요 원인이 있습니다. 하나는 **전단력(shear)**으로, 고g 원심분리기의 가장자리나 압력을 받는 필터를 가로지를 때 생기는 격렬한 유체 응력이며, 이는 단백질을 물리적으로 풀어 펼칠 수 있습니다. 다른 하나는 시간과 온도입니다. 수확물이 따뜻한 채로 오래 머물수록 죽어 가는 세포가 HCP와 프로테아제(proteases, 단백질을 잘라 내는 효소)를 액체로 더 많이 흘려보내고, 항체는 더 많이 응집합니다. 경험칙으로, 공장에서는 따뜻한 보관 시간을 짧게, 흔히 20°C 이상에서 약 4시간 미만으로 유지하려 하고, 그 밖에는 모든 것을 차갑게 둡니다. 부드럽고, 차갑고, 빠른 것이 이깁니다.

둘째, 지금 제거하지 못한 것은 나중에 일을 훨씬 더 어렵게 만듭니다. 잔해가 너무 많이 통과하면 하류 필터와 크로마토그래피 컬럼이 막히고 오염되며, 운전 압력이 치솟고, 불순물이 최종 의약품 쪽으로 따라 들어갑니다. 정화는 또한 상류 공정의 마지막 미생물 오염 방벽이기도 합니다. 심층 필터 단계는 보통 세균과 곰팡이를 3 로그 이상 걷어 내므로, 깨끗하고 잘 관리된 수확은 그 이후 모든 공정의 바이오버든(bioburden)과 안전을 직접적으로 보호합니다 [6]. HCP와 숙주세포 DNA는 환자에게 안전하지 않을 수 있으므로, 여기서 깨끗하게 출발하는 것이 뒤따르는 포획 단계를 보호합니다.

실제 현장에서는​

표준적인 상업 방식은 **유가식 배양(fed-batch culture)**입니다. 탱크에서 약 10일에서 21일 동안 세포를 키우고(정확한 기간은 세포주와 배지 설계에 따라 다릅니다), 그런 다음 끝에 가서 한 번의 큰 원심분리-여과 작업으로 배치 전체를 수확합니다. 탱크 하나, 수확 하나, 큰 정화 하나입니다. 이것은 승인된 대부분의 단일클론항체(monoclonal antibody, mAb) 뒤에 있는 검증되고 지배적인 방식이며, 앞서 설명한 디스크-스택 이후 심층 필터 순서가 그 플랫폼 주력 공정입니다 [1].

현대적이고 강화된 대안은 **관류(perfusion, 연속 배양)**입니다. 여기서는 신선한 먹이가 계속 흘러 들어오고 정화된 제품이 계속 흘러 나가는 동안, **세포 보유 장치(cell-retention device)**가 세포를 바이오리액터 안에 붙들어 둡니다. 그리고 이 장치에 대해서는 정확히 짚어 둘 필요가 있는데, 단순한 침전이 아니기 때문입니다. 실제 관류 시스템은 능동적 보유를 사용합니다 [8]:

  • 교대 접선 흐름(alternating tangential flow, ATF) — 중공사 필터(hollow-fiber filter)로, 그 안으로 액체를 앞뒤로 펌프질하여, 방향이 바뀌는 흐름이 끊임없이 섬유 표면을 쓸어 깨끗하게 유지하므로 막히지 않습니다. Repligen의 XCell ATF 시스템이 가장 잘 알려진 예입니다.
  • 음향 분리(acoustic separation) — 정상파(standing wave) 음파가 세포를 부드럽게 밀어 가라앉을 만큼 무거운 덩어리로 모으며, 오염될 필터가 아예 없습니다.
  • 고정층(packed-bed) 시스템 — 세포가 고체 기질 위에 살고 그 사이로 배지가 씻겨 흐릅니다.

이 장치들은 관류 바이오리액터가 세포를 아주 높은 밀도, 흔히 밀리리터당 2,000만~4,000만 개 이상으로 유지하게 하면서, 세포 없는 정화 제품을 몇 주 동안 날마다 꾸준히 졸졸 흘려보냅니다. 끝에 가서 한 번 거대하게 돌리는 대신, 수확은 부드럽고 연속적인 흐름이 되며, 이는 단백질이 응력을 받는 시간이 훨씬 짧아져 응집이 덜 일어나는 경향을 뜻합니다. 그 정화된 흐름은 중간에 배치 탱크 없이 곧바로 연속 포획 단계로 직접 공급될 수 있습니다.

이 연속적이고 통합된 방식, 즉 관류에 더해 연속 다중 컬럼 포획(multi-column capture)을 결합하고, 때로는 단일 인라인 스키드(skid, 프레임 위에 자족적으로 구성된 장비 단위)로 만든 방식이야말로 미국 NIIMBL 연구소가 발전을 돕고 있는 바로 그 방향입니다. NIIMBL(National Institute for Innovation in Manufacturing Biopharmaceuticals)은 민관 협력의 Manufacturing USA 연구소입니다. 델라웨어 대학교(University of Delaware)와 함께 짓고 있는 파일럿 규모 시설인 SABRE 센터는 2024년 4월에 착공했으며, 이러한 강화 공정을 파일럿 규모에서 개발하고 시연할 수 있는 실제 cGMP 시설을 목표로 합니다. (분명히 해 두자면, SABRE는 시설입니다. 실제 장비를 갖춘 건물이지, 소프트웨어 플랫폼이나 데이터 프로그램이 아닙니다.)

이 모든 것은 엄격한 규정집 안에 있습니다. 가장 큰 우산이 되는 요건은 cGMP, 즉 의약품을 어떻게 만들어야 하는지를 정한 FDA의 집행 가능한 표준입니다. 수확 장비는 정확히 21 CFR 211.67에 해당하는데, 이 조항은 장비가 제품을 오염시키거나 변질시키지 않도록 설계·세척·유지되어야 한다고 요구합니다 [5]. 이 단계가 판정받는 잔류 HCP, DNA, 응집체의 허용 한도는 생물학적 제품의 규격에 관한 국제 가이드라인인 ICH Q6B에서 나옵니다 [4]. 바이러스 및 미생물 안전성 논리는, 정화가 상류 오염 방벽의 일부라는 개념을 포함하여, **ICH Q5A(R2)**가 틀을 잡고 있으며, 2023년 개정판은 바로 이러한 연속 제조 설비를 다루도록 확장되었습니다 [6]. 그리고 이 모든 것을 하나로 묶는 것이 **품질 설계(Quality by Design, QbD)**입니다. QbD는 어떤 핵심 공정 변수(Critical Process Parameters, CPPs), 즉 여기서는 온도, 보관 시간, 원심분리기 g-힘과 공급 속도, 필터 압력이 어떤 핵심 품질 속성(Critical Quality Attributes, CQAs), 즉 HCP 수준, DNA 수준, 응집체 함량, 시각적 투명도를 좌우하는지 밝혀낸 다음, 그 변수를 제어하여 속성을 범위 안에 유지하는 규율입니다 [9]. "수확물은 맑고 무색이어야 한다"처럼 소박한 것조차 실제로 문서화된 시각적 제어 지점입니다.

핵심 용어​

  • 배양액(broth, harvest) — 바이오리액터에서 나온 뿌연 액체로, 세포와 항체, 그리고 용해된 불순물을 담고 있다.
  • 원심분리(centrifugation) — 중력의 배수(g)로 빠르게 회전시켜 무거운 세포를 바깥으로 내던져, 더 맑은 액체를 빼낼 수 있게 하는 것.
  • 디스크-스택 원심분리기(disk-stack centrifuge) — 대규모 유가식 수확을 위한 연속식 고g(10,000~20,000g) 주력 원심분리기.
  • 심층 여과(depth filtration) — 두껍고 기공 기울기를 가진 패드를 통과시켜, 표면뿐 아니라 깊이 전체에서 입자를 붙잡는 여과.
  • 정화 수확물(clarified harvest) — 맑고 거의 무색이며 세포가 없으나, 여전히 항체와 용해된 불순물을 담고 있는 액체.
  • 탁도(turbidity, NTU) — 흐림의 정도를 나타내는 척도. 수확은 액체를 1,000 NTU 이상에서 약 5 NTU 미만으로 낮춘다.
  • 상류/하류(upstream/downstream) — 세포를 키우는 일 대 제품을 정제하는 일. 수확은 그 둘 사이의 경계다.
  • 숙주세포 단백질(host cell protein, HCP) — 세포 자신의 단백질로, 여기서 2~3 로그 줄어들고 하류에서 더 제거되는 불순물.
  • 숙주세포 DNA(host cell DNA) — 세포에서 남은 DNA로, 정화 과정에서 2~4 로그 줄어든다.
  • 응집체(aggregate) — 전단력, 열, 긴 보관 시간으로 형성되는 뭉쳐서 잘못 접힌 단백질로, 최종 의약품에서 반드시 배제해야 한다.
  • 전단력(shear) — 원심분리기나 필터를 가로지를 때 생기는 격렬한 유체 응력으로, 연약한 항체를 물리적으로 손상시킬 수 있다.
  • 관류(perfusion) — 세포 보유 장치가 세포를 탱크 안에 붙들어 두는 동안 제품이 꾸준히 흘러 나가는 연속 배양.
  • 세포 보유 장치(cell-retention device) — 정화 제품이 흘러 나가는 동안 관류 바이오리액터 안에 세포를 붙들어 두는 능동적 분리 장치(ATF, 음향, 고정층).
  • cGMP — 의약품을 어떻게 만들어야 하는지를 규율하는 집행 가능한 표준인 현행 우수 제조 관리 기준.
  • 핵심 공정 변수/핵심 품질 속성(CPP/CQA) — 품질 설계가 서로 연결하는 제어 가능한 입력(온도, 보관 시간, g-힘, 압력)과 품질 출력(HCP, DNA, 응집체, 투명도).

다음 이야기​

정화 수확물은 이제 우리의 항체를 담은 맑은 액체이지만, 앞서 보았듯 여전히 용해된 HCP, DNA, 그 밖의 분자가 헤엄치고 있습니다. 다음 과제는 그 붐비는 액체 속으로 손을 뻗어 항체만 움켜쥐고 나머지는 모두 뒤에 남기는 것입니다. 그것이 바로 첫 번째이자 가장 강력한 정제 단계인 **포획 크로마토그래피(capture chromatography)**의 일이며, 여기서 프로테인 A(Protein A) 컬럼은 항체만 잡고 그 밖에는 아무것도 잡지 않도록 만들어진 분자 자석처럼 작동합니다. 다음 장 포획: 항체 움켜쥐기 (프로테인 A)에서 그 이야기로 넘어갑니다.