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세포 깨우기: 시드 트레인

📍 현재 위치: 여정의 10번째 단계입니다. 종이 위에서는 레시피를 이미 규모 확대해 두었고, 이제 얼어붙은 세포 한 바이알을 깨워 실제 배치를 시작할 수 있을 만큼 키워냅니다.

벤치탑 궤도형 인큐베이터 셰이커 안에 고정된 두 개의 삼각플라스크. 부유 배양으로 세포를 증식시키는 데 사용된다. 초기 시드 트레인 증식: 궤도형 인큐베이터 셰이커에 장착된 삼각플라스크 세포 배양액. 부드러운 회전 운동이 세포가 자라는 동안 세포를 부유 상태로 유지하고 산소를 충분히 공급한다. Culture flasks in an incubator shaker. Image by Diane A. Reid (National Cancer Institute), public domain, via Wikimedia Commons.

의약품 한 배치를 만드는 일은 얼어붙은 작은 세포 바이알 하나를 해동하는 것에서 시작합니다. 그 바이알에는 공장 규모의 탱크를 채우기에는 턱없이 적은 수의 세포만 들어 있으므로, 우리는 세포를 한 단계씩 키워 점점 더 큰 용기로 옮기며 건강한 세포의 작은 바다를 만들어 갑니다. 이렇게 단계별로 키워가는 과정을 **시드 트레인(seed train)**이라고 부릅니다.

쉽게 말하면

사워도우 발효종을 떠올려 보세요. 작은 병에 한 숟가락만큼 담긴 것에서 시작합니다. 먹이를 주고, 거품이 일고 가득 차면 더 큰 그릇에 옮겨 담아 다시 먹이를 줍니다. 빵 여러 덩어리를 구울 만큼이 될 때까지 점점 더 큰 그릇으로 계속 옮깁니다. 시드 트레인도 살아 있는 세포로 똑같은 일을 합니다. 먹이를 주고, 키우고, 한 단계 큰 용기로 옮기고, 반복하는 것이죠. 큰 탱크를 채울 만큼 충분해질 때까지요. 다른 점이라면, 모든 옮김 작업이 단 하나의 떠도는 오염 입자도 들이지 않는 방식으로 이루어져야 한다는 것입니다.

이 장에서 다루는 내용​

우리는 얼어붙은 바이알 하나가 초저온 냉동고에서 생산 바이오리액터(production bioreactor)의 문 앞에 이르기까지의 여정을 따라가 봅니다. 우리가 실제로 얼마나 적은 수의 세포로 시작하는지, 셰이크 플라스크와 락킹 백, 스테인리스 시드 탱크를 거쳐 어떻게 세포를 키워 올리는지, 그리고 이 사다리의 각 단계가 대략 얼마나 걸리는지 보게 될 것입니다. 모든 것을 조용히 망쳐버릴 수 있는 두 가지 — 미생물 오염과 "계대 변이(passage drift)" — 를 자세히 들여다보고, 업계가 이를 막기 위해 사용하는 시험과 청정실, 그리고 이름 있는 장비들도 살펴봅니다. 마지막으로, 현대식 관류(perfusion) 시드 트레인이 어떻게 같은 시간에 훨씬 더 많은 세포를 채워 넣는지, 그리고 미국의 NIIMBL 연구소와 그 SABRE 파일럿 시설이 어디에 자리하는지 알아봅니다.

실제로 일어나는 일​

우리가 사용하는 세포는 보통 **CHO 세포(CHO cells, 차이니즈 햄스터 난소 세포)**입니다. 우리의 단일클론항체(monoclonal antibody, mAb), 즉 단백질 의약품을 만들도록 앞선 단계에서 조작된 작은 살아 있는 공장이죠. 이 세포들은 **작업 세포 은행(Working Cell Bank, WCB)**에 얼려 보관되어 있습니다. 동일한 백업 바이알 수백 개로 가득한 액체 질소 냉동고로, 각 바이알은 동일하게 특성 분석된 세포주의 충실한 복제본입니다. 바이알 하나가 한 차례의 캠페인을 시작합니다.

그 시작 바이알은 정말로 작습니다. 전형적인 WCB 바이알에는 약 5~10백만 세포/mL 농도의 세포 현탁액이 1~2 mL만 들어 있으므로, 바이알 전체에는 대략 5~20백만 개의 세포가 담겨 있습니다. 물 한 모금보다 적은 부피로, 얼어 있는 동안 얼음 결정이 세포를 찢지 못하도록 막아 주는 동결보호제(cryoprotectant) 속에 부유해 있습니다. 그 한 모금에서 시드 트레인은 생산 탱크를 채우는 데 필요한 수백억 개의 세포를 만들어 내야 합니다.

시드 트레인은 보통 다음과 같이 진행됩니다.

  1. 바이알 한 개 해동. 연구원이 WCB에서 얼어붙은 바이알 하나를 꺼내, 얼음이 막 녹을 때까지 온도 조절된 수조나 건식 가온기에서 빠르게 데웁니다. 속도가 중요합니다. 천천히 해동하면 손상을 주는 얼음이 다시 생깁니다. 해동된 세포는 따뜻하고 영양이 풍부한 액체, 즉 **배양 배지(culture medium)**에 부드럽게 희석되어 동결보호제를 씻어내고, 시료를 현미경으로 확인합니다. 업계는 트레인을 계속하기 전 보통 해동 후 생존율 약 85% 이상을 요구합니다. 부실한 해동은 캠페인을 가장 먼저 탈선시키는 요인입니다.
  2. 셰이크 플라스크. 세포는 작은 플라스크로 옮겨집니다. 흔히 125 mL 또는 500 mL 코닝(Corning) 일회용 통기 병에 가령 30~100 mL의 작업 부피를 담아, 따뜻하고 가습된 인큐베이터 안의 궤도형 셰이커 위에 둡니다(보통 37°C에서 pH를 안정적으로 유지하기 위해 이산화탄소를 조절합니다). 부드러운 회전 소용돌이가 세포를 부유 상태로 유지하고 산소를 충분히 공급합니다. 거기서 세포는 분열하며 배가됩니다.
  3. 한 단계 키우기(계대 배양). 배지가 세포로 붐비게 되면, 배양액을 신선한 배지가 담긴 더 큰 용기로 나눕니다. 이 옮김을 **계대 배양(passaging)**이라고 부릅니다. 매 계대마다 세포에게 더 많은 공간과 양분이 주어지고, 팀은 매번 *계대 수(passage number)*를 꼼꼼히 기록합니다. 그 이유는 곧 나옵니다.
  4. 웨이브 백 바이오리액터. 다음으로 배양액은 흔히 락킹 "웨이브" 백으로 옮겨집니다. 밀폐된 사전 멸균 일회용 플라스틱 백으로, 예컨대 사이티바(Cytiva, 옛 GE Healthcare) WAVE 락킹 바이오리액터나 폴(Pall) Allegro XRS 락킹 백 시스템이 있으며 몇 리터를 담습니다. 교반기 대신 플랫폼 전체가 앞뒤로 흔들려 액체 표면에 파도가 일고, 임펠러의 거친 전단력 없이 산소를 부드럽게 끌어들입니다. 일회용 백은 또한 배치 사이에 세척하고 재멸균할 거대한 탱크가 없다는 뜻이기도 합니다.
  5. 시드 바이오리액터. 그다음에는 하나 이상의 **시드 바이오리액터(seed bioreactor)**가 옵니다. 벤치 및 파일럿 규모의 교반 탱크로(예컨대 **에펜도르프/뉴 브런즈윅(Eppendorf / New Brunswick)**이나 애플리콘(Applikon) 시스템, 흔히 2 L에서 10~20 L까지 운영), 각각이 앞의 것보다 큽니다. 이 탱크들은 프로브와 피드백 루프로 온도, 용존 산소, pH를 능동적으로 제어하므로, 세포가 편안한 영역에 머물며 빽빽하게 계속 증식합니다.
  6. 생산 리액터 접종. 마지막 시드 배양액이 충분히 빽빽해지면, 그것을 사용해 큰 생산 바이오리액터(본 무대)를 **접종(inoculate)**합니다. 즉 세포를 심는 것이죠. 의약품은 바로 거기서 대량으로 만들어집니다. 생산 직전의 마지막 시드 단계는 흔히 N-1 리액터라고 부르는데, 생산 "N" 탱크보다 한 단계 아래(N 빼기 1)이기 때문입니다.

이 모든 과정 내내 모든 옮김은 **무균(aseptic)**이어야 합니다. 떠도는 미생물이 단 하나도 들어가지 못하도록 하는 것이죠. 연결은 멸균 공간 안에서, 밀폐된 일회용 튜빙을 통해, 또는 두 라인을 실내 공기에 노출하지 않고 융합하는 멸균 튜브 용접기로 이루어집니다.

WCB 바이알에서 셰이크 플라스크, 웨이브 백, 시드 바이오리액터로 이어지는 시드 트레인 장비 진행 과정을 부피와 일정과 함께 보여주는 도해 시드 트레인은 12 mL 냉동 바이알(WCB)에서 셰이크 플라스크(125 mL), 웨이브 바이오리액터(25 L), 시드 바이오리액터(1020 L)를 거쳐 유가식(fed-batch) 모드로 47일에 걸쳐 물리적으로 진행된다. 각 단계는 세포 생존율과 순도를 보호하기 위해 무균 조건과 제어된 매개변수(온도, pH, 용존 산소)를 유지한다. Original diagram by the authors, created with AI assistance.

얼마나 걸리고, 세포가 얼마나 빨리 자라는가​

흔한 어림 표현으로 "CHO 세포는 대략 하루에 한 번 배가된다"고 합니다. 거의 맞지만, 정직한 숫자는 범위입니다. 건강한 유가식 시드 배양에서 CHO 세포는 클론, 배지, 온도에 따라 보통 20~30시간마다 배가되며, 잘 먹인 관류 배양은 이를 18~24시간에 가깝게 밀어붙일 수 있습니다. 배가 시간 또한 일정하지 않습니다. 세포는 해동 직후 하루쯤 지체 기간을 거치다가 속도를 올리고, 다시 배지가 붐비면서 느려집니다. 각 단계가 세포 수를 대략 배로 늘리기 때문에, 유가식 시드 트레인은 해동에서 510백만 세포/mL의 생산 접종액까지 보통 약 47일이 걸립니다. (아래에서 만나게 될 관류 시드 트레인은 더 오래 — 흔히 10~14일 — 걸리지만, 훨씬 더 빽빽하게 끝납니다.)

왜 중요한가​

시드 트레인은 나머지 공정이 의존하는 바이오매스(biomass), 즉 살아 있는 세포의 총 질량을 만들어 냅니다. 한 단계를 건너뛰면 규모의 도약이 너무 커집니다. 거대한 탱크에 떨어뜨린 듬성듬성한 세포는 너무 느리게 자라고, 건강한 범위를 벗어나 표류하며, 배치는 항체를 많이 만들기도 전에 멈춰버립니다.

하지만 가장 큰 위험은 오염이며, 왜 그런지 실감하려면 계산을 해 볼 가치가 있습니다. 세균은 CHO 세포보다 훨씬 빨리 자랍니다. 흔한 실험실 및 환경 오염균 다수 — 빠르게 자라는 그람양성 구균, 바실루스(Bacillus) 속, 이상적인 호기 조건의 대장균(E. coli) — 은 대략 20분마다 배가될 수 있는 반면, 우리의 CHO 세포는 거의 하루가 걸립니다. 청정실의 실제 오염균이 이 교과서적인 20분 속도에 이르는 일은 드물지만, 한 시간에 한 번이라는 느슨한 속도라 해도 그 격차는 엄청납니다. 대략적인 예시로, 세균 한 개가 배양액에 슬쩍 들어와 20분마다 배가된다면, 48시간 안에 원칙적으로 CHO 세포보다 수천 배 많아질 것입니다. 그보다 훨씬 전에 배지가 탁하고 산성으로 변하고, pH와 산소 센서가 흔들리며, 배양액은 망가질 것입니다. 따라서 눈에 띄지 않은 미생물 하나가 하루나 이틀 만에 시드 배양 전체를 압도하고 망쳐버릴 수 있습니다.

그래서 무균 기법과 **멸균성(sterility)**이 신성하게 다뤄지는 것입니다. 망가진 시드 트레인은 며칠간의 작업과 대체 불가능한 세포 한 바이알을 버린다는 뜻이며, 훨씬 더 나쁘게는, 오염균이 발견되지 않은 채 빠져나갔다면 하류로 흘러가는 안전하지 않은 의약품을 뜻합니다. 여기서 건강하고 깨끗하며 빠르게 자라는 세포가 이후의 모든 것을 준비합니다.

두 번째의 더 조용한 위험이 있습니다. **계대 변이(passage drift)**입니다. CHO 세포주는 완벽하게 안정적이지 않습니다. 세포가 분열할 때마다 유전적 또는 후성유전적 변화가 일어날 작은 가능성이 있고, 여러 세대에 걸쳐 이것들이 누적되면 집단이 미묘하게 바뀝니다. 때로는 항체를 덜 만들거나(더 낮은 역가(titer), 즉 배양액 속 산물의 농도) 약간 달라진 산물을 만들게 됩니다. 그래서 대부분의 CHO 세포주는 검증된 범위 안에 유지되며, 흔히 처음부터 끝까지 30~50회 계대 정도이고, 배양액이 자격이 인정된 한계를 넘어 자라지 않도록 매 옮김마다 계대 수를 추적합니다 [7]. 이것이 WCB가 중요한 또 하나의 이유입니다. 새로운 캠페인마다 저계대 냉동 바이알에서 새롭게 시작하므로, 변이가 배치들 사이로 스며들 기회가 결코 생기지 않습니다.

실제 현장에서는​

친근해 보이는 셰이크 플라스크 뒤에는 표준과 시험, 통제된 공간의 벽이 자리합니다.

작업이 이루어지는 곳. 시드 트레인 작업은 분류된 청정실(cleanroom) — 보통 ISO 7 또는 ISO 8 공기 청정도 등급 — 안에서, 세포주와 사용된 작용제에 따라 BSL-1 또는 BSL-2 생물안전 조건 하에 수행됩니다. 이 공간들은 작업일마다 모니터링됩니다. 작업자들은 능동 및 수동 공기 시료, 표면 면봉 채취, 입자 계수를 채취해 환경이 청결하게 유지되었음을 증명하며, USP 일반 챕터 〈1116〉과 무균 공정으로 생산되는 멸균 의약품에 대한 FDA 무균 공정 지침의 원칙을 따릅니다 [2]. 이 모든 것은 배치 기록(batch record), 즉 모든 단계에 대한 통제되고 추적 가능한 기록에 문서화되며, 이는 cGMP — current Good Manufacturing Practice(현행 우수 제조 관리 기준), 즉 모든 배치가 동일하게 안전한 방식으로 만들어지도록 보장하는 법적 구속력을 가진 규칙 — 의 기록 요건인 21 CFR Part 211, Subpart J에 부합합니다 [3].

세포가 신뢰받기 전에 통과해야 하는 것. WCB 자체는 철저히 특성 분석되기 전까지 사용되지 않습니다. 세포 기질에 관한 국제 지침인 ICH Q5D 하에서, 세포 은행은 산물 제조에 투입되기 전 동일성, 순도, 멸균성, 마이코플라스마, 그리고 외래성(원치 않게 우연히 들어온) 바이러스 작용제에 대해 선별됩니다 [1]. 이 시험들은 실제로 느리고, 그것이 전체 일정을 좌우합니다.

  • 멸균성 시험은 **USP 〈71〉**의 14일 방법을 따르며, 떠도는 미생물이 있다면 배양액을 멸균으로 부를 수 있기 전 2주 동안 영양 배지에서 배양합니다 [5].
  • 마이코플라스마 시험은 **USP 〈63〉**의 배양법과 지시 세포법을 사용합니다(현대식 PCR 선별은 1~3일 만에 예비 답을 줄 수 있는 반면, 완전한 공정서 배양법은 몇 주가 걸립니다) [4].
  • **엔도톡신(endotoxin)**과 해동 후 생존율(그 85% 초과 기준)이 공정 중 점검을 마무리합니다.

마이코플라스마는 특별한 두려움을 받을 만합니다. 이것은 가장 작은 자유생활 세균으로, 세포벽이 없어(그래서 일부 멸균 필터를 통과하고 많은 항생제를 떨쳐냅니다) 탁함을 전혀 일으키지 않습니다. 오염된 배양액은 완벽하게 건강해 보일 수 있지만, 그 사이 마이코플라스마가 조용히 세포의 거동과 산물을 왜곡합니다. 드렉슬러(Drexler)와 업호프(Uphoff)의 기초적인 리뷰는 세포 배양의 마이코플라스마 오염이 얼마나 흔하고 얼마나 눈에 띄지 않을 수 있는지를 정리했으며, 이것이 바로 눈에 의존하지 않고 전용의 민감한 시험이 선택이 아니라 필수인 이유입니다 [6]. 표준 멸균성 결과가 5일 만에 진행될 수 있는 배양보다 14일 뒤처지기 때문에, 제조사들은 신속한 공정 중 방법(PCR, 시료에 대한 그람 염색), 이전 로트의 깨끗한 이력, 그리고 어떤 바이알이라도 해동되기 전 세포 은행에 대한 완전한 출하 시험으로 그 격차를 관리합니다.

현대적이고 강화된 경로. 표준 상업 공정에서 시드 트레인은 유가식(fed-batch) 운전을 위해 하나의 큰 스테인리스 스틸 또는 일회용 생산 바이오리액터를 채우며 끝나고, 유가식은 오늘날 여전히 승인된 mAb의 대다수를 만듭니다. 하지만 떠오르는 방향은 강화(intensification)입니다. **연속 및 강화 공정(continuous and intensified processing)**에서는 N-1 시드 단계를 **관류(perfusion)**로 운영합니다. 신선한 배지가 계속 흘러들어오는 동안 세포 보유 장치를 통해 사용된 배지를 빼내므로, 폐기물이 결코 쌓이지 않고 세포가 비범한 밀도까지 계속 분열합니다. 이를 위해 만들어진 시스템으로는 개발용 사토리우스(Sartorius) ambr 관류 미니 바이오리액터와 음향식 또는 필터 기반 세포 보유를 사용하는 벤치탑 관류 용기가 있으며, 이들은 유가식 시드의 전형적인 5~10백만보다 몇 배 높은 20백만 세포/mL 이상의 세포 밀도에 도달할 수 있습니다. 폴샤이트(Pohlscheidt)와 동료들의 실제 산업 사례는 생산 탱크가 더 가득 찬 상태로 시작해 더 빨리 수확에 이르도록 접종 밀도를 충분히 높이기 위해 특별히 3,000 L 규모에서 N-1 관류를 운영했습니다 [8]. 더 빽빽한 시드는 생산 리액터가 앞서 출발하고, 더 생산적으로 운전하며, 더 작은 설비 면적에서 더 많은 의약품을 짜낼 수 있게 해 줍니다.

이 연속적이고 강화된 접근은 바로 미국 NIIMBL 연구소 — 민관 협력 Manufacturing USA 연구소 — 와 그 파트너들이 성숙시키려 노력하는 종류의 공정입니다. NIIMBL의 SABRE 센터(Securing American Biomanufacturing Research and Education), 즉 2024년 4월에 착공한 델라웨어 대학교의 약 70,000제곱피트 규모 파일럿 규모 cGMP 시설은, 현실적인 파일럿 규모에서 강화된 시드 및 생산 트레인을 포함한 현대식 바이오제조를 시연하고 위험을 낮추기 위해 바로 그 목적으로 건설되고 있습니다 [9]. 이곳은 데이터 프로그램이 아니라 직접 손으로 하는 공정 작업과 훈련을 위한 시설이며, 관류 시드 트레인을 규모 있게 검증해 보는 장소로서 잘 어울립니다.

핵심 용어​

  • 시드 트레인(seed train) — 해동한 바이알 하나에서 생산 리액터를 채울 만큼까지 단계별로 세포를 키우는 과정.
  • 작업 세포 은행(Working Cell Bank, WCB) — 동일하게 특성 분석된 바이알들의 냉동 보관분으로, 그중 하나가 각 배치를 시작한다.
  • 계대 배양(passaging) — 붐비는 배양액을 신선한 배지가 담긴 더 큰 용기로 옮기는 것이며, 각 옮김을 한 계대로 센다.
  • 웨이브 백 바이오리액터(wave bag bioreactor) — 임펠러 없이 흔들려 세포를 부드럽게 섞고 산소를 공급하는 밀폐 일회용 플라스틱 백.
  • 시드 바이오리액터(seed bioreactor) — 생산에 필요한 크기까지 배양액을 키우는 제어된 탱크이며, 마지막 것이 N-1 리액터다.
  • 바이오매스(biomass) — 키워낸 살아 있는 세포의 총량.
  • 접종(inoculate) — 이전 단계의 세포로 새 용기에 세포를 심는 것.
  • 무균(aseptic) — 원치 않는 미생물이 들어갈 수 없도록 수행되는 것.
  • 멸균성(sterility) — 살아 있는 미생물이 완전히 없는 상태.
  • 계대 수(passage number) — 배양액이 몇 번 나뉘었는지에 대한 누적 횟수로, 세포를 안정 범위 안에 두기 위해 추적한다.
  • 역가(titer) — 배양액 속 항체 산물의 농도.
  • 관류(perfusion) — 세포를 보유하면서 신선한 배지를 계속 공급하고 사용된 배지를 제거하여 매우 높은 세포 밀도를 가능하게 하는 것.
  • N-1 리액터(N-1 reactor) — 생산 탱크보다 한 단계 아래의 시드 바이오리액터로, 최종의 빽빽한 접종액을 만드는 데 쓰인다.
  • cGMP(current Good Manufacturing Practice, 현행 우수 제조 관리 기준) — 모든 단계에 대해 통제되고 문서화되며 추적 가능한 조건을 요구하는 법적 구속력을 가진 규칙.
  • 마이코플라스마(mycoplasma) — 세포벽이 없는 가장 작은 세균으로, 배양액을 건강해 보이게 두는 은밀한 오염균이라 특별히 시험해야 한다.
  • 청정실(cleanroom, ISO 7 / ISO 8) — 무균 작업이 수행되는, 공기 청정도가 엄격히 통제되고 모니터링되는 공간.

다음 이야기​

시드 트레인은 그 마지막의 빽빽한 시드 배양액이 큰 탱크로 펌프되어 들어가는 순간 끝납니다. 다음 장 생산 바이오리액터에서 우리는 그 본 무대 안으로 들어갑니다. 인내심 있게 키워낸 세포가 마침내 진짜 임무를 수행하며 항체 의약품을 대량으로 쏟아내는 거대한 제어 탱크 말입니다.